这一项包括几种因子，其中最重要的是底物种类和浓度，这是每种测酶活性浓度方法中首先需要选择的项目，选择恰当与否，对该酶测定至关重要。后面几项则不是每种酶测定都会遇到的选择。

（一）选合适的底物种类和浓度

如所测的酶专一性不强，可作用于多种底物，首先就需决定选择哪一类底物作为测此酶的底物。如该项酶测定主要用于临床诊疗工作，则首先应考虑选有较高诊断价值的底物。例如临床上测定酸性磷酸酶主要用于诊断前列腺癌，所选的底物应对前列腺酸性磷酸酶有较高的特异性。不易被其它组织如红细胞、血小板中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸盐最符合上述选择条件。但如进行酶基础研究，探讨其在体内作用时，则选择酶在体内的生理底物更为合适，一般而言在多种底物中，Km最小的底物往往是此酶的生理底物。

选择Km小的底物测定酶还有一个优点，就是在最大反应速度V的底物浓度也将最低。在实际工作中可能意味着试剂成本可能较低，不易出现底物难溶解的困难。

底物专一性强的酶虽然不面临上述选择，但只要所测酶催化的是可逆反应，则和专一性不强酶一样，都面临着是选择正向还是逆向反应来测定酶，不同反应方向的底物必然是不一样的。这方面的选择更多从技术和实用方面加以考虑往往选择速度较快的方向，因为这可以提高测定的灵敏度，如测定肌酸激酶（CK），由于磷酸肌酸价格昂贵且不稳定，早期多选用正向反应，底物为肌酸和ATP速度太慢，只是逆向反应的1/6，测定灵敏度太低，以致正常标本结果误差很大。近年来都改用逆向反应测定CK，明显提高CK测定的精密度和准确度。在此问题上，实用考虑也起了不小作用。例如测定乳酸脱氢酶（LD）时，如考虑到正向反应明显快于逆向反应，则应考虑以丙酮酸和NADH为底物，这正是IFCC和其它一些学会推荐的方法。但目前市售的测LD的试剂盒不少都以乳酸和NAD＋为底物。因为NAD＋价格明显低于NADH，并且稳定可长期储存。科研工作中如需测LD，还是最好采用IFCC的方法。

确定底物种类后，重要的问题是选择底物的合适浓度，在讨论此问题之前，有必要先简单复习一下底物浓度和酶反应速度之间的关系，因其不同于其它化学反应有其独特之处，图17-2很形象表示出这种差异。