SPA可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记SPA和金标记SPA技术，后者将在第七章　中叙述。标记SPA常用的酶为HRP。可应用于间接法。SPA在PAP法中可代替桥抗体。

1．SPA—HRP用于间接法的操作步骤

（1）切片经脱蜡后用0.5%H2O2—纯甲醇液处理5min以抑制内源性过氧化物酶活性。

（2）用Tris盐酸缓冲液（0.05mol/l pH7.6）洗2次，每次3min。

（3）以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。

（4）用Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

（5）加SPA—HRP（1：100～1：400）处理30min。

（6）Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

（7）DAB—H2O2显色。

（8）复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。

2．SPA用于PAP法的操作步骤

（1）切片脱蜡至水洗。

（2）80%甲醇（含0.6%H2O2）封闭内源酶活性5min。

（3）10%卵白蛋白Tris缓冲液，20min。

（4）第一抗体作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。

（5）0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl缓冲盐液洗片5min。

（6）SPA（1μg/ml）5min。

（7）Tris-HCl盐液洗5min。

（8）PAP复合物（无种属限制），5min。

（9）Tris-HCl盐液洗切片5min。

（10）DAB（0.6mg/ml），加0.01%H2O2反应5min，然后水洗。

（11）复染：常用Mayer’s苏木精液数秒至1min（视需要而定），水洗。

（12）脱水、透明、封固、镜检。

3．SPA—HRP的制备 　应用Nakane和Kawaoi1974年建立的过碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。

（1）10mg 溶于新鲜配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氢钠溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液以封闭酶分子中的氨基，使不发生酶的自身聚合，室温轻轻搅拌1h。

（2）加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批号的酶而定）的NaIO4，室温搅拌30min。

（3）加入1ml0.16mol/L乙二醇，室温轻搅1h。

（4）对1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸盐缓冲液充分透析（4℃，过夜），换缓冲液3次。

（5）加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸钠缓冲液1ml，室温轻搅2～3h。

（6）加5mg硼氢化钠（NaBH4）终止氧化，置4℃冰箱3h或过夜。

（7）对PBS透析24h，4℃离心去沉淀，半饱和硫酸铵洗沉淀结合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。

（8）对PBS充分透析，经测定后分装，贮于-20℃冰箱中保存备用。

用过碘酸钠法可以得到很高标记率的HRP-SPA标记物，而且保存了抗体的全部活性，敏感度高，稳定性强，大大优于戊二醛标记抗体法，国内现在也有HRP-SPA的标记物供应，但要注意由于各家所用的SPA可能来源于不同菌株，在性质上可能存在一些差异。

【注意事项】

①在使用二硝基氟苯后，会产生氟化氢，应充分透析除净，否则抑制酶活性。

②标记时过碘酸浓度不宜过高，氧化时间不宜过长，否则会产生过度标记，即多个酶分子结合到一个蛋白A分子上。这些过度标记蛋白A的免疫反应性很差，容易产生非特异性染色。

③标记时加入酶与SPA的比例应适合，比值过大易产生过度标记，比值小则标记蛋白A产率低。

④过碘酸氧化结果能使酶具有多个醛基，从而能与多个蛋白分子的氨基相结合，成为一些大分子的聚合物。因此，有作者强调指出，对要求具有较强的细胞穿透力的免疫细胞化学实验时应予以考虑是否适用。但国内有实验室应用上海生物制品所产生的应用过碘酸氧化法制备的HRP—SPA于免疫电镜研究仍获得了较为满意的结果。