中医书籍-->西医备考-->实用免疫细胞与核酸-->第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术-->第四节 免疫电镜胶体金标记法-->二、胶体金标记蛋白A技术(Protein A-goldtechnique, PAg法)-->2.
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在电镜技术的应用原则是二步标记法,可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在:①须1%卵白蛋白—PBs (pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液(pH7.4)来封闭非特异性的结合部位,而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清,因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合,从而给出假阳性结果;②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时,应用的PBS或TBS的pH应变更为pH7.4。在变更这两步后,其它可参照本节 中包埋前、后染色法进行。也可采用下列步骤进行包埋后染色。
(1)载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上,室温约5min。
(2)载网不冲洗,直接移至第一抗血清液滴上,在室温孵育2h或4℃18~24h。
(3)PBS冲洗3min×2次。
(4)将PAg原液稀释10~20倍,载网浮于该液滴上,室温孵育1h。
(5)PBS冲洗5min×2次。
(6)5%醋酸铀水溶液染色,水洗。
(7)枸椽柄铅染色。
(8)电镜观察。
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