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二、末端标记法

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在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶(T4PNK)的催化下,将γ-32P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为:

此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为Bio –11 –dUTP,也可以在3’端标记上一个生物素。

寡核苷酸35S的3’—末端标记法:将下列液体依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸(1 pmol)1μl

10×Tailingbuffer 2μl

[α-35S]2μl

双蒸馏水14μl

末端脱氧核苷酸酶1μl(10Unit)

混合后,置于37℃水浴中1.5h。取出反应管放入冰水中5min。加入下列液体:

TRNA(25mg/ml)3μl

1×TE(pH8.0)180μl

酚100μl

CTAa100μl

充分混合2min。离心15000r/min 5min。将上清液(约200μl)移入新的Eppendorf 管中,然后加入下列液体:

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

混匀,置冰浴中,15min。再15000r/min离心10min,在管底可见一白色沉淀块(含tRNA及寡核苷酸)。吸去管中液体,然后加入1000μl80%酒精,混合1~2min同上离心,吸除酒精(勿破坏沉淀块),将管置于40℃温箱中5min。加入适量的1×TE(pH8.0)及0.5mol/l DTT溶解沉淀。标记探针的最终浓度是0.5ng/μl,DTT的最终浓度为20mmol/μl。取出1μl标记探针测定比放射性,应在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1~2个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。

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