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四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法

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此法是在亚硫酸盐催化下,生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基,使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术,检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰,此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下,可有3%~4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液,两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l (pH6.0),加入对苯二酚,使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500~800bp长度的片段,煮沸法变性,取1份DNA与9份上述混合液混合,42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5)在40℃下充分透析,浓缩DNA,再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH8.5),再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂,室温反应2h,用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)在40℃下充分透析,纯化,-20℃保存。

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