（一）DNA的酶切与连接

（1）酶切反应

同质粒DNA的鉴定，只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切，则成比例增加。

（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

（3）15000rpm离心15min，弃上清。

（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

（5）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

（6）测定DNA的含量。

（7）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

（9）关于待插入DNA片段的获得参见附注。

（二）大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1．感受态的制备

（1）接种单菌落于2mlLB培养液中， 37℃过夜。

（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2．重组DNA的转化

（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：

（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

（3）42℃90s。

（4）37℃水浴5min。

（5）加入无相应抗生素的Lb200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

（三）转化子DNA的快速鉴定－快速细胞破碎法

（1）挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。

（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。

（3）加入70μlCracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。

（4）15000rpm离心15min。

（5）吸取上清点样电泳，观察。

（四）转化子DNA的酶切鉴定

1．转化子DNA的快速少量抽提

（1）同本节　二.（三）.1.

（2）菌液移至5mlEppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。

（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。

（4）15000rpm离心15min。

（5）吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。

（6）15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。

（7）离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。

（8）取少量DNA电泳，观察浓度。

2．转化子DNA的小量酶切鉴定同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节　一（三）。

（五）重组子DNA的进一步鉴定

可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节　四。

[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

（1）用合适的酶切割DNA并电泳。

（2）于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。

（3）将透析袋（纵长）与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

（4）取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。

（5）吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。

（6）加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。

（7）于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。

（8）用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

（9）真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。