血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C₃的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

1．化学法

化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。

2．酵法测定

CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成△4胆甾烯酮和H₂O₂。再分别定量O₂的消耗或者H₂O₂的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

一、Abell-Kendall改良法

1．原理

血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

2．试剂组成

代号 种类 浓度 组　成 贮存2～8℃ 有效时间 R1 乙醇 　 优质纯 　 　 R2 石油醚 　 沸点68℃，特级纯 　 　 R3 水醋酸 　 分析纯 　 　 R4 无水醋酸 　 胆固醇分析用，不含HCI 　 　 R5 浓硫酸 　 分析纯 　 　 R6 KOH液 33%(W/W) KOH10g+H₂O20ml 　 　 R7 乙醇性KOH液 　 R194ml+R66ml 　 临用前配制 R8 Liebermann 　 　 　 配制后 　 Burchard 　 R420体积+R51体积+R310体积 　 1h 　 试剂* 　 　 　 内用完 R9 胆固醇标准液 5.17mmol/L 胆固醇标准品200mg+R1→100ml 0 　

*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。

3．操作

图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图

按图15-1操作。

4．计算

标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

二、酶法（CEH、COD-POD法）

首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂，再H₂O₂经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。

H₂O₂+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

（一）手工测定法

1．试剂组成

代号 种类 浓度 组成 贮2～8℃ 有效时间 　 Na₂HPO₄ 50mmol/L 　 　 　 　 Na₂H₂PO₄ 50mmol/L 　 　 　 　 胆酸钠 3mmol/L 　 　 　 　 4-氨基安替比林 0.82mmol/L 　 　 　 R1* ESPAS 14mmol/L 　 　 24h 　 Carbowax-6000 0.17mmol/L 　 　 　 　 CEH 33U/L 　 　 　 　 COD 117U/L 　 　 　 　 POD 6700U/L 　 　 　 R2 标准液 5.17mmol/L 用异丙醇溶解胆固醇 　 　

*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

2．操作

按图15-2操作。

3．计算

标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

（二）自动化分析仪测定

以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

1．试剂组成

A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

B液：COD、4-氨基安替比林等。

图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图

2．上机参数

项　目 参　数 方　法 终点法 波　长 双波长（540nm，700nm） 反应温度 37℃ 试剂A反应时间 2～3min 试剂B反应时间 5～6min 样本用量 3μl 试剂A用量 250μl 试剂B用量 120μl 单位 mmol/L

3．操作过程

4．计算

以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

5．注意事项

（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

（2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。

（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。